【正海新知】PCR實驗室建設工程注意事項

PCR實驗室建設指的是基因擴增實驗室，主要用來做DNA類的研究與檢測。目前，對于此次新冠病毒肺炎疫情核酸檢測中，國家對基因擴增實驗室的建設越來越得到重視，因為它對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用。多年來正海實驗室做過很多PCR實驗室建設的案例，根據經驗為大家總結了以下PCR實驗室建設工程注意事項，內容如下：

一、 PCR實驗室平面布局

臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區域：試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區、擴增產物分析區。為避免交叉污染，進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物配制和擴增區→擴增產物分析區。

各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。

二、實驗室空調通風系統設計及壓力控制

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區的壓力要求。

1、試劑貯存和準備區

該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區，不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。

對與氣流壓力的控制，本區并沒有嚴格的要求。

2、標本制備區

該區域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動。

3、擴增反應混合物配制和擴增區

該區域主要進行的操作為DNA或 cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的 cDNA(來自樣本制備區) 的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區) 制備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式 PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。

本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。

4、擴增產物分析區

該區域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區域可不設。

本區是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。

三、污染的預防與控制

PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結果必須作廢，需重新進行實驗。所以發生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。

1、工作區域的嚴格劃分

（1）各個實驗區域設置合理；

（2）各個實驗區域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區域設備物品、試劑等發生混淆。

2、合理的系統設置

（1）合理的空調通風系統設置，盡量采用全送全排的空調系統；

（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區內不同的壓力要求。

3、規范的操作

（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；

（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；

（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區進行清潔。除常規的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設備還應進行高壓消毒處理。

4、嚴格的管理

（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區的門；

（2）在各個實驗區域使用帶有明顯區別標志的工作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將本區的工作服帶至其它區域；

（3）盡量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。

（4）擴增產物分析區是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理，如焚燒等；

（5）擴增產物分析區可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。

5、完備的實驗室配套設施

完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。

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