【正海新知】PCR實驗室為什么要進行三區隔離？

PCR實驗室總是出現假陽性，明明沒有加模板，最后卻擴出了產物。如果這種現象頻頻出現，就要注意一下操作環境了。

PCR反應過程中不斷進行升溫降溫，液體蒸發又冷凝，PCR管中部分空氣形成氣溶膠，攜帶大量的DNA擴增產物（注意，1ng擴增產物中可作為模板的DNA片段數量，超過1ng起始模板中可擴增DNA片段數量的幾百萬倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個bp，要擴增的單拷貝基因片段是300bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬分之一）。如果在實驗室打開含PCR擴增產物的管蓋，大量攜帶DNA擴增產物的氣溶膠就會涌出，擴散到空氣中，從而對環境造成污染。

雖然在整個空間環境中DNA的含量很低，但由于理論上只要有1個可做為模板的DNA片段也能PCR擴增成功，這就是為什么在污染環境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。

所以在專業的PCR實驗室（比如臨床PCR檢驗實驗室），通常有四區隔離（或至少是三區隔離）的要求。

常見的三區是指：

1、試劑配制區：PCR反應體系的配制區域。 

2、標本處理區：包括擴增模板的制備，即提取DNA的地方。

3、PCR擴增和產物分析區：進行PCR擴增的區域，也是擴增產物進行凝膠電泳分析的區域。 

如果將PCR擴增區域和產物分析區再次分開，就是四區隔離。四區隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個PCR區域之間的流動，最好的方法是每個區域隔一幢樓，但操作起來不現實，于是便有了針對不同區域設置正負壓的方法： 

試劑配制區（Ⅰ區）：最潔凈的區域，保持微正壓使得外界空氣無法進入隔離污染源。并且陰性模板應該在此區加入PCR管并蓋蓋，嚴禁在此區域打開、存放裝有DNA模板的離心管。

DNA模板添加區（Ⅱ區）：壓力比Ⅰ區低，保證內部空氣不外泄，以免陽性模板的氣溶膠對外界環境造成污染。

擴增及PCR產物分析區（Ⅲ區）：保持負壓，使得內部空氣不外泄，以免擴增產物的氣溶膠對外界環境造成污染。

操作時壓力遵循Ⅰ區→Ⅱ區→Ⅲ區單一方向進行，不可逆向進行。

既然PCR三區隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請注意以下細節，思考一下氣溶膠來自哪里：

 1. 每個區域都應配備專用的移液器，不可交叉混用。我們的一位用戶拿電泳室的移液器加模板，陰性對照擴出了很亮的條帶。 

2. 每個區域都應配備專用的移液器吸頭，不可交叉混用。 

3. 如果條件允許，在PCRⅢ區工作結束后再次進入PCR I區需要更換實驗服、一次性鞋套、帽子、手套。 

4. 在PCR I區、PCRⅡ區配備帶濾芯吸頭。